7  生物室主要仪器

仪器设备的正确使用是确保实验室安全和实验顺利进行的关键。以下是一些重要的注意事项和操作方法，涵盖了生物室的设备使用方面的内容：

这些注意事项和操作方法将有助于保障实验室设备的安全运行和实验的顺利进行。接下来，我们将详细介绍一些常见设备的使用方法和操作注意事项，以便实验室成员能够更好地掌握设备的使用技巧，并在实验中取得更好的结果。

▲CRITICAL后续参考文献部分均经过挑选，以确保内容的准确性和可靠性。并尽可能减少视频长度，方便观看。

7.1 洁净仪器

7.1.1 离心机

用前准备

  1. 打开电源开关，确定显示编号与转头相符。
  2. 检查离心机内部是否有异物，如有异物应及时清理。
  3. 检查离心机转头盖是否拧紧无缝隙，确认无误后方可启动离心机。
  4. 检查转头无异常碰擦声响，过大振动和噪音；若存在异常立即停止使用，排除故障后继续使用。

操作步骤

  1. 设定所需转速和离心时间。

▲CRITICAL再次检查转头编号和显示数字是否一致。

  1. 将离心管管壁擦拭干净中心对称或轴对称放入离心机内，如样品数量不够需要配平。

! CAUTION务必按照 图 7.1 放置离心管，并在下一步前再次检查离心管是否放置正确，高速离心如未配平会引起严重后果。

  1. 旋盖离心管需要检查管盖是否拧紧，高速离心管需要盖紧后加盖转头盖。
  2. 开始离心，离心过程中不得随意离开，应随时观察离心机上的仪表是否正常工作，如有异常的声音应立即停机检查，及时排除故障。
  3. 在离心机完全停止后方可开盖拿取离心样品。
  4. 检查离心机转头，及时清洗、擦干，关闭电源。

注意事项

  1. 转头是离心机中须重点保护的部件，轻拿轻放，保持洁净干燥。
  2. 低温离心时，转头在使用前应放置于冰箱中进行预冷，离心结束后倒置转头并擦干腔内余水。
  3. 开机前必须检查转头和转头盖是否拧紧无缝隙，确认无误后方可启动离心机。

参考资料

根据实验室已有型号转子，离心时请参考如下图片进行配平，如遇到无法配平情况，请自行增加配平离心管或增加离心批次。

图 7.1: 6孔离心机（8000 rpm离心机及污泥脱水离心机）
图 7.2: 24孔离心机（Eppendorf离心机）

7.1.2 超净工作台

用前准备

  1. 穿戴好实验服，佩戴好手套。

! CAUTION实验服和手套能有效防止微生物进入人体和向周围环境传播。

  1. 检查超净工作台设备情况，在设备良好的情况下继续使用。
  2. 在飞书上进行预约登记，登记链接

▲CRITICAL预约登记可以更高效的安排多人实验进程，同时记录操作内容方便回溯污染来源。

! CAUTION多次使用且未登记者被查明后，会安排其进行生物室的整体污染去除清洁（啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊）。

操作步骤

  1. 使用前30分钟放入实验所需用品，打开紫外灯，照射20分钟后打开风扇，对操作区域进行灭菌。

▲CRITICAL务必在紫外灯开启20分钟后再开启风扇（否则臭氧浓度不够达不到杀菌效果），紫外灯照射时间不得超过30分钟，以免过快减少紫外灯管寿命。

  1. 打开日光灯和风扇进行实验操作。

! CAUTION务必检查紫外灯已经关闭，避免皮肤和眼睛灼伤。

  1. 操作过程中拿取物品，需要将物品和双手喷涂酒精后再重新进入超净工作台。
  2. 操作结束后整理工作台面，喷洒75%乙醇溶液，并用内置酒精棉球由内向外擦拭干净，打开紫外灯照射20分钟，结束使用。

! CAUTION实验结束后，未清理台面，残留多余培养皿、细菌等污染性质物品，将会被安排清洁，多次未清理者会安排其进行生物室的整体污染去除清洁（啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊）。

注意事项

  1. 实验操作过程中禁止打开紫外灯。
  2. 操作过程遇到飞虫进入，立即停止操作，在没有实验用菌的情况下进行紫外消杀。
  3. 紫外灯不可长时间（< 45min）开启。
  4. 接触电器开关需保持手部干燥。
  5. 保持工作台内干燥和清洁。
  6. 他人使用超净台时，尽可能减少超净台附近的走动。
  7. 尽可能减少手部饰品、手表的佩戴。

操作技巧

  1. 实验操作复杂可提前将打印好的操作步骤黏贴于超净台上方。
  2. 操作过程中人为将台面分为污染高、低风险区（按照个人操作习惯）。
    • 高风险区：放置废液缸、取样菌种、含有样品的培养皿等。
    • 低风险区：移液枪、涂布棒、平板、未加菌的培养体系、枪头等。
  3. 所有离心管和玻璃瓶在使用完成后对敞口进行密封。
  4. 为避免污染，可用无菌墙头作为离心管开盖器。

仪器维护

  1. 定期检查紫外灯管发光处氧化情况。
  2. 定期擦拭超净台隔断玻璃内外面。
  3. 定期检查超净台隔断玻璃密封条状态。
  4. 定期检查超净台滤网洁净程度。

参考资料

  1. 超净工作台内部操作
  2. 超净工作台使用说明

7.1.3 qPCR仪

用前准备

  1. 穿戴好实验服，佩戴好手套。
  2. 检查金属孔板内无异物。

操作步骤

  1. 打开仪器开关。
  2. 新建实验文件，并对照实验设计方案填写对应孔板内容。
  3. 开始扩增后，等待仪器进入循环阶段，直至实验结束。
  4. 清理孔板内扩增产物及桌面，并关闭仪器电源。

注意事项

  1. 实验开始前需要仔细检查8联管盖与管子本身的契合状态，并检查对应联管内有无气泡。

▲CRITICAL盖子未盖紧会导致样品逸散，直接导致仪器污染。

  1. 实验结束后如需进行后续跑胶、测序等实验，应将扩增产物黏上封口膜后于-20/-80 ℃冷冻长期保存或4 ℃短期保存。

▲CRITICAL禁止在生物室打开扩增产物管盖，此举会造成污染（16S rRNA质控 \(C_T < 20-24\) ）并导致qPCR检测长时间暂停（至少2个月）。

  1. 使用电脑登记过程中，禁止佩戴手套，以免污染鼠标和键盘。

操作技巧

  1. qPCR相对丰度配套\(\Delta \Delta C_T\)法脚本较为完善，为使用该脚本请将实验文件名称规范命名为“姓名英文首字母和日期形式”。

! CAUTION首字母和日期之间不得有空格，日期格式为“YYYYMMDD”或近似格式用于脚本识别及污染发生后的溯源，命名例：XXX20240101。

▲CRITICAL名称不规范造成的溯源困难，将会被视为污染源头，后果参见上述注意事项。

仪器维护

  1. 定期用棉签沾拭仪器孔板内部。
  2. 注意保持仪器干燥。

7.2 热源仪器

7.2.1 数显恒温水浴锅

用前准备

  1. 本仪器使用电源为220V交流电，使用前请确定电源插座额定电流不小于10A，并具有安全接地装置，否则请更换插座
  2. 在使用该仪器之前，如有实验液体撒入箱体内，应及时擦洗干净以免腐蚀仪器
  3. 检查振荡器内用水状况

操作步骤

  1. 设定摇晃速度，培养温度，确保振荡器内水位高度（一般高于震荡台）
  2. 将所需震荡物品密封后平稳放置在暂停摇晃的震荡台上（倾斜可能导致甩出）
  3. 打开开关，开始摇晃培养

注意事项

  1. 当仪器托盘做振荡时，请勿将手伸入工作室内接触正在振荡的托盘或烧瓶
  2. 在使用振荡功能时，以防烧瓶甩出，应在振荡器停止的状态下，才能打开仪器门。在放好烧瓶后，关闭好振荡培养箱门后，方可启动振荡功能
  3. 仪器应做好经常性清洁工作（震荡期内水应干净无异味、异物），保持工作台面和操作面板的整洁
  4. 仪器应旋转平稳，不能侧倾使用
  5. 设备在搬运时，倾角不得大于45度
  6. 摇晃溶液不得大于瓶身\(\frac{2}{3}\)

仪器维护

  1. 仪器内水产生异味，伴有异物需取出培养样品，全面清洁摇床内部
    • 倒净摇床内部用水，拆下摇床
    • 用刷子彻底清洁摇床和基座内部
    • 用配置好的84溶液浸泡洗净的摇床和基座内部30分钟，冲洗干净
    • 组装并重新添加水浴用水

7.2.2 高温烘箱

用前准备

  1. 观察烘箱内有无易燃物、可燃物、异物等危险物质，在使用前及时清理。
  2. 观察烘箱周围有无易燃物、可燃物、异物等危险物质，在使用前及时清理。

操作步骤

  1. 打开电源，设定目标温度，等待升温。
  2. 放置物品时，上下四周应留存一定空间，保持箱内气流畅通。
  3. 取物时佩戴隔热手套，缓慢打开箱门，切勿在高温状态下快速或急速开启箱门。
  4. 通用电热恒温鼓风干燥箱可放置污染样品（污泥烘干），分子生物专用电热鼓风干燥箱（仅可放置无菌无酶离心枪头、离心管、试管架等）。
  5. 将箱门轻轻关闭，检查箱门与硅胶密封条结合情况。

注意事项

  1. 含易燃易爆等有机挥发性溶剂或助剂禁止放入箱内。
  2. 关闭时不可太用力，避免造成箱体大幅振动。
  3. 戴隔热手套取样，避免烫伤。
  4. 拿取物品时避免头部直接正对箱门开口，需待箱内热量散失5-10秒。
  5. 废弃物品不可随手弃置于烘箱周围。
  6. 在断电室温情况下用酒精擦拭烘箱内部和样品架表面，清理掉落标签，等待酒精充分挥发后关闭箱门通电。
  7. 禁止过夜使用烘箱，避免发生火灾。

7.2.3 高压灭菌锅

用前准备

  1. 穿戴好实验服，戴好隔热手套。
  2. 检查底部放气阀是否处于开放状态。

! CAUTION 放气阀开放可确保锅内压力维持在安全状态。

  1. 检查灭菌锅水位，高水位指示灯。
  2. ! CAUTION 检查锅盖排气阀、安全阀状态。
  3. ! CAUTION 检查灭菌压力设置。
  4. 观察高压灭菌锅周围有无易燃物、可燃物、异物等危险物质，在使用前及时清理。
  5. 观察高压灭菌锅内有无易燃物、可燃物、异物等危险物质，在使用前及时清理。
  6. 进行灭菌日期、操作人员和灭菌物品登记。

操作步骤

  1. 将需灭菌的物品放入灭菌锅内，不可过多、堆叠放置。
    • 玻璃瓶类：培养液、培养基、缓冲液、无菌水等需要摇匀后略松瓶盖。
    • 离心管类：5 mL及以下离心管装入烧杯后用锡箔纸封闭杯口后放入，5 mL及以上离心管需要管盖分离灭菌（防止内外压力过大使离心管变形）。
    • 枪头类：装填完成后密封放入。
    • 配水桶需要检查桶内是否有残存液体，及液体性质不得为易挥发、易燃、易爆、有毒物质。
  2. 打开电源，观察高水位指示灯是否常亮。

! CAUTION高水位指示灯常亮表示水位正常，否则需接适量纯水进行补充。禁止使用自来水添加，该行为会增加桶内结垢腐蚀，形成安全隐患。

  1. 设置时间和温度后（一般不需操作，但需检查），旋紧锅盖，开始升温，并观察安全联锁灯是否亮起。
  2. 灭菌锅开始工作（待温度升至98-100 °C，关闭下方排气阀），同时检查后方集水桶是否摆正。

! CAUTION不得触碰上方排气阀。

  1. 等待灭菌锅继续升温至121 °C，若安全阀无异响，锅盖无漏气，方可继续灭菌。
  2. 灭菌结束后，自然冷却（80 °C以下），确认压力表示数归零，缓慢打开底部排气阀，排尽剩余气体后，佩戴隔热手套，拿取灭菌物品。
  3. 将锅内物品取出放入烘箱或室温冷却（装有试剂的玻璃瓶盖需要拧紧，未装有试剂的玻璃瓶需要取下瓶盖）。
  4. 切断电源。

注意事项

  1. 前三次使用必须有人在旁指导
  2. 气未放尽前，不得开启高压锅
  3. 灭菌物品应符合高压灭菌要求
  4. 放进去的瓶子表面都不要有污垢，长期会腐蚀灭菌锅
  5. 操作过程中小心烫伤
  6. 灭菌液体不得超过所装容器2/3
  7. 不得图省事过夜灭菌，避免发生安全事故
  8. 锅内物品需要保持一定空隙，严禁挤压内筒

▲CRITICAL灭菌锅属于特种安全设备，如多次违规操作并引发安全事故，会背负法律责任。

仪器维护

  1. 定期清理内筒。
  2. 定期检查压力设置。
  3. 定期检查安全阀和排气阀情况。

应急预案

  1. 运行过程中遇到停电时：关闭电源，打开排气阀。
  2. 运行中低水位报警时：关闭电源，打开排气阀，待蒸汽排空后，添加纯水至高液位指示灯亮起。
  3. 运行中压力表显示正常，安全阀出现排气或压力表失灵时：立即关闭电源，打开排气阀直至压力表归零，通知检修人员维修，记录异常内容。
  4. 运行中安全阀工作异常，压力超高无法泄压时：立即关闭电源，打开排气阀直至压力表归零，通知检修人员维修，记录异常内容。
  5. 温度达不到设定温度时：立即关闭电源，打开排气阀直至压力表归零，通知检修人员维修，记录异常内容。
  6. 不明原因报警时：立即关闭电源，打开排气阀直至压力表归零，通知检修人员维修，记录异常内容。
  7. 筒体出现形变，泄露等异常情况时：立即关闭电源，打开排气阀直至压力表归零，通知安全负责人员，停止使用。

7.3 低温冰柜

用前准备

  1. 佩戴防低温手套
  2. 检查冰柜温度情况

操作步骤

  1. 打开冰柜柜门后提取所需离心管盒存放架
  2. 拿取需要的样品，并放回离心管盒存放架
  3. 关闭冰柜门，确保密封

注意事项

  1. 冰柜柜门上不得放置任何物品
  2. 小心冻伤

7.4 恒温培养箱

操作步骤

  1. 设定培养温度
  2. 打开箱门，放入密封、标记好的样品
  3. 关闭并密封箱门

注意事项

  1. 箱壁内胆和设备表面要经常擦拭，以保持清洁
  2. 把需作培养实验的物品放入培养箱工作室内，上、下四周应留存一定空间保持工作室内气流畅通，关好箱门

7.4.1 移液枪

用前准备

  1. 检查移液枪各部分完整度，确保套筒（5）洁净
图 7.3: Brand移液枪结构图

操作步骤

  1. 调节操作容量
    • 顺时针调低容量，一步到位直接使用
    • 逆时针调高容量，应先调至超过设定体积刻度，再回调至设定体积，保证移液器的精确度
  2. 枪头装卸
    • 选用对应量程匹配的枪头
    • 竖直嵌入并左右旋转拧紧枪头
    • 严禁竖直敲打牢固枪头
图 7.4: 枪头装配示意图
  1. 吸液及放液

    • 吸液

      • 按照吸取液体体积，确定枪头浸没深度

      • 在转移液体前应润洗1-3次

        正向吸液（适用于流动性较好，粘度较低液体）

        • 按下配药按钮到第一阶段

        • 将移液管尖端垂直浸入液体

        • 保持浸没深度，缓慢回弹配药按钮，等待液体被吸取 如有必要将枪头尖端多余液体挂回离心管壁

        • 将移液管尖端以陡峭角度放在离心管壁上

        • 慢慢按下配药按钮至第一阶段，充分排出液体后按至第二阶段

        • 按住分配按钮将枪头尖端多余液体挂回离心管壁，缓慢回弹分配按钮

        反向吸液（适用于粘度较高，易起泡液体）

        • 按下配药按钮到第二阶段

        • 将移液管尖端垂直浸入液体

        • 保持浸没深度，缓慢回弹配药按钮，等待液体被吸取 如有必要将枪头尖端多余液体挂回离心管壁

        • 将移液管尖端以陡峭角度放在离心管壁上

        • 慢慢按下配药按钮至第一阶段

        • 按住分配按钮将枪头尖端多余液体挂回离心管壁，缓慢回弹分配按钮

        • 丢弃多余液体

图 7.5: 吸液深度最佳示意表

注意事项

  1. 使用完成后务必将量程调到最大
  2. 使用前后均需消毒移液枪表面
  3. 使用后应放置在移液枪架上
  4. 当移液器枪头里有液体时，切勿将移液器水平放置或倒置，以免液体倒流腐蚀活塞弹簧
  5. 分配按钮需要缓慢操作，放置速度过快，液体冲入移液枪内部
  6. 提前熟悉各移液枪适配枪头的最大量程（一些枪头不能达到移液枪最大量程），尤其在进行反向吸液操作时需要注意量程

仪器维护

  1. Eppendorf手动移液器维护保养
  2. Brand手动移液器维护保养
  3. 大龙移液枪的日常维护与校准

参考资料

  1. 移液枪使用手册
  2. 移液枪量程设置
  3. 移液枪枪头润洗
  4. 移液枪浸入深度和吸液角度
  5. 移液枪吸液操作
  6. 移液枪分液操作
  7. 移液操作循环
  8. 移液枪正反向移液
  9. 涡旋振荡器和移液枪-溶液混匀
  10. 正确使用移液枪